دانشکده علوم پایه-گروه زیستشناسی
کارشناسی ارشد رشته بیوشیمی
عنوان:
بررسی اثر بوریک اسید بر مورفولوژی و توان زیستی سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت
استاد راهنما:
دکتر محمد حسین آبنوسی
پژوهشگر:
بنتالهدی موحدی نجفآبادی
دانشگاه اراك
دی ماه 1393

حمد و ثنا مخصوص خداوندی است که عطش علم و دانش را در وجودمان به ودیعه نهاد تا ظلمت جهل و نادانی را به روشنایی فهم و کمال بیاراییم.
خداوندا به ما توفیق تلاش در شکست، صبر در نومیدی، رفتن بی همراه، جهاد بی سلاح، کار بی پاداش، فداکاری در سکوت، دین بی دنیا، مذهب بی عوام، عظمت بی نام، خدمت بی نان، ایمان بی ریا، خوبی بی نمود، گستاخی بی خامی، مناعت بی غرور، عشق بی هوس، تنهایی در انبوه جمعیت و دوست داشتن بی آنکه دوستت بدارند، را عنایت فرما.
شایسته است به عنوان ادای حق، مراتب تشکر خالصانه خود را تقدیم دارم به:
جناب آقای دکتر محمدحسین آبنوسی ، استاد راهنما و تشکر می کنم از جناب آقای دکترسید محمدعلی شر یعت زاده و دکتر هادی انصاری که زحمت داوری این پایان نامه را بر عهده گرفتند.
از مدیریت محترم گروه زیستشناسی، از خانم ها غلامی و شجاع فر، از مسئولین محترم آزمایشگاه جناب آقای فراهانی، خانم مالکی، خانم اسکندری، خانم نادری، آقای بنه و آقای احمدی به پاس مساعدتهایشان قدردانی می کنم. از دوستان عزیزم خانمها مدبریان، قنبری، احمدی، شاهدی، شریف، سلمانی که هر یک به نوبه خود خالق بهترین و به یادماندنی ترین خاطراتم هستند صمیمانه سپاسگذارم.
تقدیم به برادرانم:
که همواره متحمل زحماتم هستند و تکیه گاه من در مواجه با مشکلات، و وجودشان مایه دلگرمی من می باشند.
تقدیم به خواهرانم :
که وجودشان شادی بخش و صفایشان مایه آرامش من است.
تقديم به پدر و مادر عزيزم 
خدای را بسی شاکرم که از روی کرم پدر و مادری فداکار نصیبم ساخته تا در سایه  درخت پر بار وجودشان بیاسایم و از ریشه آنها شاخ و برگ گیرم و از سایه وجودشان  در راه کسب علم ودانش بهره جویم .
والدینی که بودنشان تاج افتخاری است بر سرم و نامشان دلیلی است بر بودنم چرا، که این دو وجود پس از پروردگار مایه هستی ام بوده اند دستم را گرفتند و راه رفتن را در این وادی زندگی پر از فراز و نشیب آموختند. 
آموزگارانی که برایم زندگی؛ بودن و انسان بودن را معنا کردند
حال این برگ سبزی است تحفه درویش تقدیم آنان….
به پاس تعبیر عظیم و انسانی شان از کلمه ایثار و از خودگذشتگی 
به پاس عاطفه سرشار و گرمای امیدبخش وجودشان که در این سردترین روزگاران بهترین پشتیبان است 
به پاس قلب های بزرگشان که فریاد رس است و سرگردانی و ترس در پناهشان به شجاعت می گراید
و به پاس محبت های بی دریغشان که هرگز فروکش نمی کند.
این پایاننامه با حمایت مالی حوزه معاونت پژوهشی و فناوری دانشگاه اراک انجام شد، در این خصوص از مسئولین مربوط تشکر به عمل میآید.
چکیده
بررسی اثر بوریک اسید بر مورفولوژی و توان زیستی سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت
بنت الهدی موحدی
مقدمه: بور ریز مغذی ضروری برای گیاهان است و مطالعات نشان داده که این عنصر می تواند به عنوان یک ریزمغذی برای حیوانات و انسان نیز محسوب شود. در این پژوهش به منظور درک بهتر از نقش بور، اثر دوزهای مختلف اسید بوریک بر توانایی حیات، تکثیر، تمایز و فاکتورهای بیوشیمیائی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت (MSCs) مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روشها: MSCs تا سه پاساژ کشت و برای بررسی توان تکثیر و تمایز در محیطهای کشت فاقد ترکیبات استئوژنیک و واجد ترکیبات استئوژنیک آلوده به اسید بوریک قرار داده شد. در بخش اول که شامل بررسی توانائی تکثیر میشود، توانایی حیات با کمک تست MTT و تریپان بلو در زمانهای 12، 24و 36 ساعت بررسی و دوزهای 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک و زمان 36 ساعت جهت انجام مطالعه انتخاب گردید. در ادامه، توانائی تکثیر با استفاده از توانایی تشکیل کلونی (CFA) و دو برابرشدگی جمعیتی (PDN)، مورفولوژی سلول ها توسط رنگ آمیزی فلوروسنس، سطح الکترولیتهای سدیم، پتاسیم با استفاده از فلیم فتومتر و میزان کلسیم، میزان فعالیت آنزیمهای LDH، ALP ،AST و ALT توسط کیتهای تجاری ارزیابی شد. در بخش دوم که شامل بررسی توانائی تمایز میشود، تاثیر دوز 6 نانو و میکروگرم بر میلیلیتر به عنوان دوزهای منتخب در زمانهای 5، 10، 15 و 21 روز بر توانایی زیستی، مورفولوژی، سطح الکترولیتها و فعالیت آنزیم هایLDH ،AST و ALT در سلول ها تمایز یافته بررسی شد. میزان تمایز با استفاده از روش کمی آلیزارین رد، غلظت کلسیم و فعالیت آنزیم ALP مورد ارزیابی قرار گرفته و داده ها توسط روش آماری ANOVA، آزمون tukey آنالیز و p<0/05 به عنوان سطح معنی دار در نظر گرفته شد. نتایج: نتایج بدست آمده نشان داد که در سلول های مزانشیم میزان توانایی زیستی در دوز و زمان کم تغییر نمی کند، اما افزایش در هر دو فاکتور زمان و دوز، کاهش فعالیت آنزیمهای متابولیکی و متعاقبا حیات را بدنبال داشت. در سلولهای استئوژنیک فقط در دوز بالا و با گذشت زمان منجر به کاهش توانایی حیات سلولی شد و دوز 6 نانوگرم هیچ اثری بر روی توانایی حیات نشان نداد ضمنا فاکتورهای تمایزی، الکترولیتها و آنزیمهای متابولیکی با افزایش زمان فقط در دوز 6 نانوگرم افزایش یافت. نتیجه گیری: تاثیر اسید بوریک به نوع سلول و شرایط تیمار وابسته است به گونه ای که در این مطالعه نشان داده شد که حساسیت سلولهای مزانشیم نسبت به سلولهای استئوبلاست بیشتر است. علاوه بر این دوز پایین اسیدبوریک دارای تاثیر مثبتی بر روند تمایز استخوان بود، لذا دوزهای پایین اسید بوریک می تواند نقش مفیدی بر سلامت سلول های مزانشیم و تمایز آنها به استئوبلاست داشته باشد.
کلید واژهها: سلول های بنیادی مزانشیم مغز استخوان، اسید بوریک، قابلیت حیات، آنزیمهای متابولیکی، تمایز
فصل اول: کلیات و هدف1 سلولهای بنیادی …………………………………………………………………………………………………………………………..11-1- 1 تعریف سلولهای بنیادی………………………………………………………………………………………………………….21-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی……………………………………………………………………………………………….31-1-3 دستهبندی سلولهای بنیادی بر اساس توان تمایزی آنها ……………………………………………………….41-1-4 دستهبندی سلولهای بنیادی بر اساس منشا …………………………………………………………………………..41-1-4-1 سلولهای بنیادی جنینی………………………………………………………………………………………………………61-1-4-2 سلول بنیادی خون بند ناف…………………………………………………………………………………………………..71-1-4-3 سلولهاي بنیادي بزرگسالان………………………………………………………………………………………………….. 101-1-5 سلولهای مغز استخوان ……………………………………………………………………………………………………………101-1-5-1 سلولهای بنیادی خونساز……………………………………………………………………………………………………..111-1-5-2 سلول مزانشیم مغز استخوان…………………………………………………………………………………………………12 تاریخچه سلول بنیادی مزانشیم ……………………………………………………………………………………………………131-2-1 مورفولوژی سلول بنیادی مزانشیم …………………………………………………………………………………………….141-2-2 کنام سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان ……………………………………………………………………………….151-2-3 ویژگیهای اساسی سلول بنیادی مزانشیم ……………………………………………………………………………….16 کاربردهای سلول بنیادی مزانشیم در درمان ………………………………………………………………………………..171-3-1 ترمیم استخوان ………………………………………………………………………………………………………………………….171-4 بافت استخوان ……………………………………………………………………………………………………………………………….201-5 استئوژنز(استخوان‌سازی) ………………………………………………………………………………………………………………211-5-1 استخوانسازی اولیه یا جنینی ………………………………………………………………………………………………….231-5-2 استخوانسازی ثانویه ………………………………………………………………………………………………………………..231-5-3 دوبارهسازی استخوان ………………………………………………………………………………………………………………..241-6 هتروژن بودن کشت سلول بنیادی مزانشیمی ……………………………………………………………………………….251-6-1 شرایط آزمایشگاهی تمایز مزانشیم به استخوان ……………………………………………………………………….251-6-2 تنظیم مولکولی تمایز به استخوان سلول‌های بنیادی مزانشیمی ……………………………………………..271-6-3 نقش سیگنال دهی Wnt در تمایز سلول های بنیادی مزانشیم به استخوان …………………………291-7 عنصر بور ……………………………………………………………………………………………………………………………………….301-7-1 مشتقات بور ……………………………………………………………………………………………………………………………….321-7-2 فراوانی عنصر بور ……………………………………………………………………………………………………………………….321-7-3 تاریخچه مصرف بور …………………………………………………………………………………………………………………..331-7-4 منابع طبیعی بور…………………………………………………………………………………………………………………………341-7-5 اثرات بور برفلزات ضروری برای متابولیزم در جانوران ……………………………………………………………..341-7-5-1 تاثیر بور بر فیزیولوژی بدن ………………………………………………………………………………………………….361-7-5-2 تاثیر بور بر روی سرین پروتئازها ………………………………………………………………………………………….371-7-6 کاربرد بور در دارو …………………………………………………………………………………………………………………….371-7-7 سرطان ………………………………………………………………………………………………………………………………………391-8 اثرات بور روی استخوان ………………………………………………………………………………………………………………..401-9 بور و خون ………………………………………………………………………………………………………………………………………411-10 بور در گیاهان ………………………………………………………………………………………………………………………………421-11 سمیت بور ……………………………………………………………………………………………………………………………………441-12 محدوده استفاده بور …………………………………………………………………………………………………………………….45مروری بر مطالعات گذشته …………………………………………………………………………………………………………………….47هدف مطالعه ………………………………………………………………………………………………………………………………………….فصل دوم: مواد و روشها502-1 انتخاب رت ……………………………………………………………………………………………………………………………………502-2 جدا سازی وتكثير سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان ……………………………………………………….522-2-1 اجرای پاساژ ………………………………………………………………………………………………………………………………542-3 اثبات مزانشیم بودن سلول های استخراج شده …………………………………………………………………………….542-3-1 تمایز به استخوان ……………………………………………………………………………………………………………………..552-4 بررسی توان زیستي سلولها (دوز فايندينگ) …………………………………………………………………………………552-4-1 رنگ آمیزی تریپان بلو ……………………………………………………………………………………………………………..572-4-2 سنجش تترازولیوم (MTT) …………………………………………………………………………………………………….572-4-2-1 مراحل انجام سنجش MTT)غیر استئوژنیک( …………………………………………………………………..582-4-2-2 ترسیم منحنی استاندارد با استفاده از سنجش تترازولیوم …………………………………………………592-4-2-3 مراحل انجام تست MTT استئوژنیک ………………………………………………………………………………..602-5 انتخاب دوز مورد نظر …………………………………………………………………………………………………………………..602-6 بررسی توان تکثیری سلولهای بنیادی مزانشیم ………………………………………………………………………….612-6-1 سنجش توانایی کلونیزایی ………………………………………………………………………………………………………..632-6-2 محاسبه تعداد دوبرابرشدگی جمعیتی(PDN) ………………………………………………………………………..622-7 بررسي تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ آميزي فلوروسنت ……………………………………………..652-8 آزمونهای بیوشیمیایی در شرایط تمایز و غیرتمایزی ………………………………………………………………….652-8-1تیمار و استخراج عصاره سلولی …………………………………………………………………………………………………..652-8-2 بررسی فعالیت آنزیمها ………………………………………………………………………………………………………………662-8-2-1 تهیه ی نمودار استاندارد برای آزمایش لاوری …………………………………………………………………….662-8-2-2 ترانس آمینازها …………………………………………………………………………………………………………………….682-8-2-3 لاکتات دهیدروژناز………………………………………………………………………………………………………………..702-8-2-4 آنزیم آلکالین فسفاتاز ……………………………………………………………………………………………………………722-8-3 سنجش ميزان رسوب ماتريكس معدني به كمك رنگ آليزارين رد در سلول های استئوژنیک722-8-3-1 رسم منحنی استاندارد برای رنگ آمیزی آلیزارین رد ………………………………………………………..732-8-3-2 بررسی رسوب ماتریکس استخوانی در نمونه های تیمار شده ……………………………………………732-8-4 بررسی الکترولیت ها )کلسیم، سدیم و پتاسیم( …………………………………………………………………….732-8-4-1 بررسی میزان کلسیم داخل سلولی با استفاده از کیت کلسیم به روش رنگ سنجی …………742-8-4-1-1 مراحل انجام تست کلسیم در سلول های تمایز یافته )استئوبلاست( …………………………..752-8-4-1-2 مراحل انجام اندازهگیری میزان کلسیم …………………………………………………………………………..762-8-4-2 اندازهگیری غلظت سدیم و پتاسیم سلول استئوژنیک و غیر استئوژنیک …………………………..812-9 تجزیه و تحلیل آماری داده ها ……………………………………………………………………………………………………….فصل سوم: نتایج823-1 الف: نتایج مرحله اول ……………………………………………………………………………………………………………………823-1-1 رشد و تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیم ………………………………………………………………………………….823-1-2 اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت ……………………853-1-3 بررسی مورفولوژی سلولهای تیمار شده …………………………………………………………………………………..873-1-4 نتایج توانایی کلونی زایی، تعداد دوبرابر شدگی جمعیت سلول ……………………………………………..893-1-5 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی …………………………………………………………………………….913-1-6 میزان الکترولیتها………………………………………………………………………………………………………………………923-2 نتایج اثر دوزهای انتخابی اسید بوریک بر شاخص های تمایز به استئوبلاست …………………………..923-2-1 توانایی زیستی سلولها در روند تمایز ………………………………………………………………………………………..933-2-2 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگآمیزی فلورسنت در نمونههای استئوژنیک963-2-3 بررسی اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی سلولهای تمایز یافته ………………………………..973-2-3-1 میزان معدنی شدن ماتریکس با سنجش رنگ آلیزارین رد ………………………………………………..1003-2-3-2 میزان رسوب کلسیم …………………………………………………………………………………………………………..1013-2-3-3 بررسی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز …………………………………………………………………………………1013-2-3-2 بررسی فعالیت آنزیم آسپارتات و آلانین ترانس آمیناز ………………………………………………………..1033-2-3-5 بررسی فعالیت لاکتات دهیدروژناز ……………………………………………………………………………………..1033-2-3-6 بررسی سطح الکترولیت های سلولهای استئوژنیک ……………………………………………………………
فصل چهارم: بحث و نتیجهگیری1054-3 اثر اسیدبوریک بر سلولهای مزانشیم ……………………………………………………………………………………………..1054-1-1اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی و توان تکثیر سلولها …………………………………………………………….1084-1-2 بررسی تاثیر اسید بوریک بر تغییرات مورفولوژیکی …………………………………………………………………1094-1-3 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی ………………………………………………………………………………1134-1-4 اثر اسید بوریک بر فعالیت آنزیمهای متابولیکی ……………………………………………………………………..1164-2 اثر اسیدبوریک بر تمایز سلولی ……………………………………………………………………………………………………1164-2-1 توانایی زیستی …………………………………………………………………………………………………………………………..1194-2-2 بررسی سطح الکترولیت ها ……………………………………………………………………………………………………….1204-2-3 بررسی فاکتورهای استئوژنیک …………………………………………………………………………………………………1244-2-4 بررسی اثر اسید بوریک بر آنزیم های متابولیکی …………………………………………………………………….1274-2-5 تاثیر اسید بوریک بر مورفولوژی سلولهای تمایزی ………………………………………………………………….1284-3 نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………………………………………1294-4 پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………………………………………..فصل پنجم:ضمیمه1315-1 روش تهیه محیط کشت ……………………………………………………………………………………………………………….1315-2 تهیه ی فسفات بافر سالین PBS- ……………………………………………………………………………………………..1325-3 تهیه ی فسفات بافر سالین مثبت PBS+……………………………………………………………………………………..1325-4 روش تهیه محیط تمایزی استئوژنیک …………………………………………………………………………………………..1335-5 آماده سازی آلیزارین رد ……………………………………………………………………………………………………………….1335-6 روش تهیه محلول تریپانبلو 4/0 درصد ………………………………………………………………………………………1335-7 تهیه کریستال ویولت ……………………………………………………………………………………………………………………1335-8 روش تهیه محلول MTT……………………………………………………………………………………………………………1335-9 روش تهیه بافر شست و شو( ( Tris-Hcl-NaCl……………………………………………………………………1335-10 مواد لازم و روش تهیه بافر استخراج ( Tris-Hcl) …………………………………………………………………1345-11 روش تهیه بافر ARS …………………………………………………………………………………………………………………1345-12 روش تهیه محلول BSA ……………………………………………………………………………………………………………1345-13 روش تهیه محلول کمپلکس لاوری …………………………………………………………………………………………1355-14 روش تهیه بافر استخراج کلسیم ……………………………………………………………………………………………….1355-15 روش تهیه رنگ های فلورسنس هوخست و آکریدین اورنژ ……………………………………………………….
فهرست اشکال2شکل1-1: توانائی خودنوزائی و پتانسیل تمایز در سلولهای بنیادی ……………………………………………………..4شکل 1-2: دستهبندی سلولهای بنیادی براساس پتانسیل تمایزی آنها …………………………………………….5شکل 1-3: تصویر شماتیک از سلولهای بنیادی جنینی …………………………………………………………………….6شکل 1-4: نمایی از بند ناف و ژله وارتون …………………………………………………………………………………………….11شکل 1-5: سلول بنیادی خون‌ساز ……………………………………………………………………………………………………….13شکل 1-6: عملکردهای اصلی سلول بنیادی مزانشیم ………………………………………………………………………….14شکل1-7: مورفولوژی فیبروبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمال از مغز استخوان …………………………….15شکل 1-8: کنام سلول‌های بنیادی مغز استخوان …………………………………………………………………………………16شکل 1-9: کاربرد سلول بنیادی مزانشیم در درمان …………………………………………………………………………….17شکل1-10: استفاده از سلول بنیادی مزانشیم در ترمیم جراحات استخوان ……………………………………….18شکل1-11: ساختمان استخوان ……………………………………………………………………………………………………………19شکل1-12: منشا سلول‌های تشکیل دهنده استخوان ………………………………………………………………………….22شکل 1-13: فرآیند استخوانی شدن درون غضروفی ……………………………………………………………………………22شکل 1-14: استخوان‌سازی درون‌غشایی ……………………………………………………………………………………………..24شکل1-15: دوباره‌سازی استخوان، جذب استخوان ……………………………………………………………………………..26شکل1-16: مراحل فرآیند استئوژنیک و ژنهای کنترلی آن …………………………………………………………………27شکل1-17: تصویر شماتیک از مسیر سیگنال دهی Wnt ………………………………………………………………….29شکل 1-18: جایگاه بور در جدول تناوبی عناصر ………………………………………………………………………………….30شکل 1-19: اسید بوریک …………………………………………………………………………………………………………………….35شکل 1-20: کمپلکس دی آدنوزین فسفات با بور ……………………………………………………………………………….36شکل 1-21 : میانکنش بور با جایکاه فعال آنزیم سرین پروتئاز …………………………………………………………..37شکل1- 22: آنتی بیوتیک تارترولون …………………………………………………………………………………………………….39شکل1- 23: Bortezomib ……………………………………………………………………………………………………………….42شکل 1-24: شکلگیری کمپلکس رامنوگالاکتورونات در دیواره سلولی گیاهان ………………………………….51شکل 2-1: انجام فلش اوت مغز استخوان …………………………………………………………………………………………….52شکل 2-2 نحوه قرار دادن فلاسک به انکوباتور …………………………………………………………………………………….53شکل 2-3: لام نئوبار …………………………………………………………………………………………………………………………….55شکل 2-4: ساختار آلیزارین رد …………………………………………………………………………………………………………….55شکل 2-5: ماتریکس استخوانی رنگ آمیزی شده با آلیزارین رد………………………………………………………….56شکل 2-6: ساختار تریپان بلو ………………………………………………………………………………………………………………57شکل 2-7: تغییر رنگ MTT بر اثر آنزیمهای میتوکندریایی و تولید بلور فورمازان …………………………58شکل 2-8: دستگاه ELISA READER ………………………………………………………………………………………..59شکل 2-9: نمودار استاندارد MTT ……………………………………………………………………………………………………..61شکل 2-10: توانایی تشکیل کلونی (CFA) ………………………………………………………………………………………..61شکل 2-11: ساختمان کریستال ویولت ……………………………………………………………………………………………….64شکل 2-12: میکروسکوپ فلورسانس المپوس …………………………………………………………………………………….64شکل 2-13: ساختار رنگ فلورسنس هوخست …………………………………………………………………………………….64شکل 2-14: ساختار رنگ فلورسنت آکریدین اورنژ ……………………………………………………………………………..66شکل 2-15: نمودار استاندارد لاوری …………………………………………………………………………………………………….67شکل 2-16: آسپارتات آمینوترانسآمیناز ……………………………………………………………………………………………..67شکل 2-17 آلانین ترانس آمیناز……………………………………………………………………………………………………………68شکل2-18 کیت های آنزیمی ALT، AST و ALP ………………………………………………………………………..69شکل2-19 : لاکتات دهیدروژناز …………………………………………………………………………………………………………..شکل 2-20: منحنی استاندارد آنزیم های اکسیدوردوکتاز……………………………………………………….70شکل 2-21: آلکالین فسفاتاز………………………………………………………………………………………………………………….72شکل 2-22: غلظت های مشخص مورد استفاده در رسم منحنی استاندارد ………………………………………..72شکل 2-23: نمودار غلظت های مشخص از رنگ آلیزارین رد ……………………………………………………………..76شکل 2-24: دستگاه اسپکتوفتومتر ……………………………………………………………………………………………………..77شکل2-25 : نمای شماتیک دستگاه فلیم فتومتر ………………………………………………………………………………..78شکل2-26: دستگاه فلیم فتومتر …………………………………………………………………………………………………………79شکل2-27: نمودار استاندار سدیم ………………………………………………………………………………………………………..79شکل2-28: نمودار استاندارد پتاسیم …………………………………………………………………………………………………….83شكل3-1. مراحل رشد سلول‌هاي بنيادي مزانشيم طي پاساژ‌هاي مختلف …………………………………………86شکل 3-2. رنگ آمیزی فلورسنت سلول های با فلورسنس رنگ هوخست …………………………………………87شکل 3-3. رنگ آمیزی سلول بنیادی مزانشیم تمایزیافته با رنگ آکریدین اورنژ ……………………………88شکل 3-4: تصاویر میکروسکوپی و ماکروسکوپی کلونی های تشکیل شده …………………………………………95شکل 3-5 رنگ آمیزی فلورسنت سلول های بنیادی تمایزیافته با فلورسنس رنگ هوخست …………….96شکل 3-6. رنگ آمیزی فلورسنت سلول های بنیادی تمایز یافته با فلورسنس رنگ آکریدین اورنژ98شکل 3-7A:تصاویر ماکروسکوپی ماتریکسهای رنگآمیزی شده با آلیزارین رد ………………………………..99شکل 3-7B: تصاویر میکروسکوپی ماتریکسهای رنگآمیزی شده با آلیزارین رد ………………………………115شکل 4-1: نمای شماتیک تغییرات بیوشیمیائی احتمالی در روندکاهش متابولیزم گلوکز…………..
فهرست جداولجدول1-1: سلول‌های مشتق شده از سلول‌های خون‌ساز و مزانشیم مغز استخوان …………………….12جدول1- 2: منابع طبیعی بور ………………………………………………………………………………………………………………33جدول1- 3: غلظت بور در بافت های مختلف ………………………………………………………………………………………43جدول1-4: وابستگی جذب بور به جنس و وزن …………………………………………………………………………………..44جدول 3-1 مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول ها با رنگآمیزی تریپانبلو ………………………………..84جدول 3-2 مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول با تست MTT …………………………………………………….85جدول3-3 مقایسه میانگین قطر هسته و مساحت سیتوپلاسم سلو لهای بنیادی مزانشیم……….87جدول3-4 مقایسه میانگین تعداد و قطر کلونی های تشکیل شده توسط سلولهای مزانشیم……….89جدول 3-5 مقایسه میانگین تعداد دوبرابرشدگی جمعیت سلول های بنیادی مزانشیم ………………..89جدول 3-6 مقایسه میانگین فعالیت (IU/L) آنزیم های (AST)، (ALT)، (LDH) و (ALP) سلولهای بنیادی مزانشیم ……………………………………………………………………………………………………………………91جدول 3-7 مقایسه میانگین میزان کلسیم، سدیم و پتاسیم داخل سلولی مزانشیم …………………………..92جدول 3-8 مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول های استئوژنیک با تست MTT …………………………93جدول 3-9 مقایسه میانگین قطر هسته (میکرومتر) سلو لهای استئوژنیک ………………………………………..94جدول 3-10 مقایسه میانگین مساحت سیتوپلاسم سلو لهای استئوژنیک …………………………………………94جدول 3-11 مقایسه میانگین میزان رنگ (میلیگرم) آلیزارین رد استخراج شده از سلول های استئوژنیک97جدول 3-12 مقایسه میانگین میزان کلسیم (میلیگرم بر دسیلیتر) در نمونههای استئوژنیک100جدول 3-13 مقایسه میانگین میزان فعالیت آنزیم ALP (IU/L)در نمونه های استئوژنیک ……………101جدول 3-14 مقایسه میانگین میزان فعالیت آنزیم AST (IU/L)در نمونه های استئوژنیک …………..102مقایسه میانگین میزان فعالیت آنزیم ALT (IU/L)در نمونه های استئوژنیک ………………………………….102جدول 3-16 مقایسه میانگین میزان فعالیت آنزیم LDH (IU/L)در نمونه های استئوژنیک …………..103جدول 3-17 مقایسه میانگین میزان سدیم در نمونه های استئوژنیک ……………………………………………….104جدول 3-18مقایسه میانگین میزان پتاسیم در نمونه های استئوژنیک ………………………………………………104
فصل اول
کلیات و هدف
فصل اول
کلیات و هدف
1-1 سلولهای بنیادی
1-1-1 تعریف سلولهای بنیادی
به طور نرمال سلولهای تخصص یافته بدن مثل سلول پوست یا سلول عصبی در تمام دوره زندگی به همان صورت باقی میمانند، اما در بدن سلولهای دیگری به نام سلولهای بنیادی وجود دارند که توانایی تبدیل به سلولهای دیگری چون سلول قلب، عصبی، ماهیچه و ……. را دارا میباشند (1).
سلولهای بنیادی1 سلولهایی غیر تخصصی2 در بدن هستند که قابلیت تمایز به سلولهای تخصصیافته را با کسب کلیه اعمال سلولی تخصصی دارند. این سلولها دارای دو ویژگی اساسی یعنی توانایی تقسیم و تولید سلولهایی با خواص یکسان (خودنوزایی)3و ایجاد انواع سلولهای تمایزیافته می‌باشند (شکل 1-1)(1).
به دلیل اینکه این سلولها منشا تولید بقیه انواع سلولها هستند واژه بنیادی در مورد آنها به کار میرود به عبارت دیگر یک سلول بنیادی، سلولی است که به دلیل توانایی کسب کلیه اعمال تخصصی قابلیت تبدیل به سلولهای تخصص یافته را دارد. این سلولها جهت تمایز نیازمند دریافت سیگنال هستند. قاعدتاً یک سلول بنیادي تا قبل از دریافت یک سیگنال جهت تکامل به سلول تخصصی به صورت غیرتخصصی باقی میماند. سلولهاي بنیادي در بدن انسان ویژگی تمایز به بسیاري از سلولها را دارند. همچنین به عنوان سیستم ترمیم به خدمت گرفته میشوند زیرا که توانایی تقسیم بدون محدودیت براي جایگزینی دیگر سلولها را دارا میباشند. وقتی یک سلول بنیادي تقسیم میشود هر سلول جدید بدست آمده این پتانسیل را دارد که سلول بنیادي باقی بماند یا به سلول تخصصی جدید مثل سلولهاي خونی و … تمایز یابد (1).
1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی
تکثیر یا خودتجدیدی، توانایی سلولها در تولید نسخههای یکسان از خود، توسط تقسیم میتوز در یک دوره زمانی مشخص است به صورتی که خصوصیات ژنتیکی و کاریوتایپی در سلولهای دختری عینا شبیه سلولهای مادری باقی میماند.
خودتجدیدی سلولها بنیادی تحت تاثیر سیگنالهای درونی سلول بنیادی که به صورت تقسیم متقارن و نامتقارن است، قرار دارد. علاوه بر این سیگنالهای درونی، خودتجدیدی سلولهای بنیادی تحت تاثیر عوامل محیطی چون آسیب یا صدمه نیز میباشد و تحت تاثیر این شرایط یک سلول بنیادی ممکن است دو سلول دختری ایجاد کند که یا به صورت سلولهای بنیادی باقی میمانند یا متمایز میشوند (2).
1-1-3 دستهبندی سلولهای بنیادی بر اساس توان تمایزی آنها:
سلول های بنیادی بر اساس توان تمایزی به صورت زیر دسته بندی می شوند:
الف) همه توان4: واژه Totipotent از دو قسمت Toti= همه، potent= توانایی تشکیل شده است. از جمله این سلولها میتوان بلاستومرهای یک جنین دو سلولی را نام برد که قادر است همه سلولهای بدن یک فرد کامل را بسازد. این سلول‌ها می‌توانند به انواع سلول‌های جنینی و برون جنینی تمایز پیدا کنند و اندام‌های قابل زیستی را ایجاد نمایند.
ب) پر توان5: این نوع سلولها قادر به ساخت غالب یا همه سلولهای فرد هستند. به عنوان مثال سلولهای بنیادی جنینی تحت شرایط خاص میتوانند یک فرد را بسازند ولی قادر به ایجاد سلولهای جفت نیستند. سلول‌های بنیادی جنینی و سلول‌های پر توان القایی جز این دسته از سلول‌های بنیادی می‌باشند.
پ)چند توان6: سلولهاي بنيادي هستند كه به تعداد محدودتری از انواع سلول‌ تمایز پیدا می‌کنند (در بافتهاي بزرگسال نظير مغز، مغز استخوان، كبد و… وجود دارند).
ت) یک توان7: توانایی ایجاد یک نوع سلول را دارند ولی توانایی خود نوزایی خود را حفظ کردهاند. مانند سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی که توانایی تولید اسپرم را دارند (شکل 1-2) (3).
شکل 1-2: دستهبندی سلولهای بنیادی براساس پتانسیل تمایزی آنها (www. njavan.com).
1-1-4 دستهبندی سلولهای بنیادی بر اساس منشا
سلولهای بنیادی بر اساس منشا به سه دسته اصلی تقسیمبندی میشوند:
1-1-4-1 سلولهای بنیادی جنینی
کشت موفقیت آمیز آزمایشگاهی سلولهای بنیادی جنینی انسانی (ESCs) 8 در سال 1998 توسط تامپسون و همکارانش انجام گرفت.
سلولهای بنیادی جنینی از توده سلولی داخلی (ICM)9جنین در مرحله بلاستوسیت به دست میآیند. بلاستوسیت مرحلهای از تکوین پیش از لانهگزینی در پستانداران است که معمولا چهار تا پنج روز بعد از لقاح ایجاد میشود. در این مرحله جنین 200-100 سلول دارد و به صورت کرهای توخالی است. این کره متشکل از یک لایه سلولی برونی (تروفواکتودرم) است که به طور معمول پس از لانهگزینی در رحم، بخشی از جفت را میسازد. همچنین این کره مجتمعی از سلولها (حدود 30-20سلول) در داخل کره به نام توده سلولی داخلی است که قادرند لایههای مختلف جنین کامل را تولید کنند (شکل 1-3) (4).
شکل 1-3: تصویر شماتیک از سلولهای بنیادی جنینی که توانایی ایجاد سلولهای هر سه لایهی زایندهی جنینی را دارا میباشد و همچنین سلولهای بنیادی بالغ که توانایی خودنوزایی و تمایز را دارند (5) .
1-1-4-2 سلول بنیادی خون بند ناف10
خون بند ناف غنی از سلولهای بنیادی و سلولهای خونساز است. این سلول‌ها بسیار پرتوان و نامیرا هستند و همچنین در اثر تکثیرهای پی در پی دچار پیری نمی‌شوند، به طوریکه با تزریق‌ و یا جایگزینی آنها در بافت‌‌هایی که آسیب جدی دیده‌اند می‌توانیم به بهبودی و تشکیل سلول‌های جدید بافت کمک نمائیم. خون بند ناف دارای 6/0 تا 1 درصد سلول‌های پیش‌ساز خونی و بنیادی خون‌ساز است. ژله وارتون بند ناف منبع غنی از موکوپلیساکاریدها بوده که سلولهای بنیادی بالغ نیز در آن یافت میشود (6). خون بند ناف دارای مزایای زیادی چون محدود نبودن به اهداکننده، بلوغ کمتر سلول نسبت به سلول‌های فرد بالغ و کاهش احتمال پسزدگی پس از پیوند می‌باشد (7). همچنین خون بند ناف را می‌توان ذخیره نمود و در موارد نیاز برای خود شخص یا فرد دیگری استفاده نمود. استفاده از این سلول‌ها در درمان بیماری‌ها چندان معمول نیست ولی این سلول‌ها در درمان دیابت نوع 1، بیماری‌های قلبی و عروقی، لوپوس اریتماتوس، بیماری‌های نورولوژیک مانند سکته مغزی، پارکینسون و آلزایمر، کم‌خونی‌ها و نقص ایمنی و بیماری‌های کبدی به کار می‌رود (شکل 1-4) (6).
شکل 1-4: نمایی از بند ناف (رگ‌های بند ناف (2 سرخرگ و یک سیاهرگ) و ژله وارتون11 و غشا خارجی) (www.mdpi.com).
1-1-4-3 سلولهاي بنیادي بزرگسالان (Adult stem cells):
انواع سلول بنیادی بالغ

بسیاری از بافتهای بالغ حاوی سلولهای بنیادی هستند و قدرت تمایز و توانایی خود نوزایی را دارند، به این سلولها سلولهای بنیادی بالغ گفته می‌شود. در زیر چند مثال از این نوع سلول‌ها آورده شده است:
الف) سلول بنیادی عصبی
سلول بنیادی عصبی، سلول پرتوانی است که:
1) قادر به تکثیر و تولید پیش‌سازهایی است که قابلیت تبدیل به سه نوع اصلی سلول‌های سیستم اعصاب مرکزی را دارند: یعنی آستروسیت‎‌ها، الیگودندروسیت‌ها و نورون‌ها.
2) این سلول‌ها توانایی خودنوزایی را داشته و همچنین به صورت متقارن و نامتقارن تقسیم میگردند.
3) یک سلول بنیادی عصبی خصوصیت پرتوانی خود را تا زمانی طولانی حفظ میکند (8).
ب) سلول بنیادی قرنیه: سلول بنیادی قرنیه در منطقه لیمبوس قرار گرفته است.‌ تکثیر سلول‌های بنیادی لیمبال در نتیجه تقسیم نامتقارن صورت می‌گیرد. سلول‌هایی که در ناحیه قاعده لیمبال واقعند ویژگی‌های تکثیری سلول‌های بنیادی را نشان می‌دهند. این سلول‌ها نسبت به سلول‌های اپی‌تلیال مرکزی و محیطی قرنیه از پتانسیل بالاتر تکثیر در محیط کشت برخوردارند، همچنین در ترمیم زخم‌های قرنیه‌ای موثر می باشند (9).
پ)سلول بنیادی سرطان
سلول های بنیادی سرطان، سلول هایی هستند که در تومورها و یا سرطان های خون یافت می شوند که ویژگی تبدیل شدن به همه ی انواع سلول که در اندام میزبان یافت می شود را دارند. سلول های بنیادی سرطانی، تومورزا (تومورژنیک) هستند و از طریق فرایند خود تجدیدپذیری و تمایز چندین نوع سلول سرطانی را تولید میکنند. چنین سلول هایی در تومور به صورت جمعیتی مجزا باقی مانده و سبب عود کردن و متاستاز و ایجاد تومور جدید می شوند. در درمان های ویژه ای که سلول های بنیادی سرطانی را هدف قرار می دهد، امید بهبود بیماران مبتلا به سرطان و کیفیت زندگی آنها به ویژه برای کسانی که با متاستاز سرطان روبه رو هستند را بیشتر می کند (9).
کارآمدی و موفقیت درمان سرطان در مرحلهی اول با میزان بریدن توده تومور12 سنجیده می شود. اما سلول های بنیادی سرطان می توانند در بخش خیلی کوچکی از بقایای تومور با فعالیت خود تومور جدیدی بسازند. روش های متداول شیمی درمانی سلول ها تمایزیافته یا در حال تمایز را که در قسمت عمدهی توده توموری هستند را هدف قرار می دهند اما باید توجه داشت که این سلول ها تنها حجم تومور را می سازند و قادر به تولید سلول های جدید نیستند و در پیشرفت بیماری و رشد تومور نقشی ندارند در حالیکه جمعیت بن یاختههای سرطانی که سرطان و رشد تومور را سبب می شوند، دست نخورده و دور از چشم باقی مانده و باعث عودکردن بیماری می شوند.
وجود بن یاختههای سرطانی موضوع بحث برانگیزی در تحقیقات بالینی است چرا که مطالعات موفق نشده اند شباهتها و تفاوتهای بین بافت سلول های بنیادی معمولی و سلولهای بنیادی سرطانی را پیدا کنند (10). بدلیل باقی ماندن جهشهای زیادی که لازمهی سرطان زایی است، سلولهای سرطان باید قادر به ادامهی تکثیر و ایجاد سلولهای بنیادی جدید باشند چرا که سلولهای تمایزیافته نمیتوانند به طور نامحدود تقسیم شوند (11).
به علاوه منشا سلولهای بنیادی سرطانی هنوز مورد سوال است، آیا آنها از سلولهای بنیادی منشا میگیرند که توانایی تنظیم تکثیر خود را از دست دادهاند یا از جمعیتهای تمایزیافتهای از سلولهای مولد که توانایی اکتسابی خودتجدیدپذیری، که مربوط به شکلگیری سلولهای بنیادی است را دارند.
اولین شواهد برای سلولهای بنیادی سرطانی در سال 1997 در مجله پزشکی نیچر چاپ شد. بونت و دیک (12) یک زیر جمعیت از سلولهای لوسمیا را جداسازی کردند که نشانگر سطحی CD34 را بیان میکند اما فاقد نشانگر CD38 است. آنها ثابت کردند که این سلولها قادر به ساختن تومور در موشهای با نقص ایمنی میباشند که از لحاظ بافتشناسی مشابه سلولهای دهنده است.

ت)سلول بنیادی پرتوان القاشده(iPSCs)13:
سلول‌های بنیادی القا شده پرتوان، از سلول‌های سوماتیکی با افزایش بیان چهار فاکتور اختصاصی جهت برنامه‌ریزی مجدد سلول (Myc، Oct4، Sox2، KIf4) تولید می‌شوند. این سلول‌ها از نظر ژنتیکی، اپی‌ژنتیکی و معیارهای تکاملی، بسیار به hESC ها شبیه هستند. به عبارتی قادر به خودنوزایی نامحدود به صورت in vitro و تمایز به هر سه لایه جنینی می‌باشند (13).
در سال 2007 محقق ژاپنی به نام شینیا یامانکا14 و همکاران سلول بنیادی پرتوان القا شده را با استفاده از دستکاری ژنتیکی سلول‌های پوست بدست آورد. در این سلولها ژن‌های رایج در سلول بنیادی، در سلولهایی که آنها نوآرایی شده بیان شدند. یامانکا ژن‌های نوآرایی شده را به واسطه وکتورهای رتروویروس‌ها، به سلولهای پوست انتقال داد. در سال 2009 یک گروه کانادایی به راهنمایی آندراس ناگی15 اولین گروهی بودند که این سلول‌ها (iPSCs) را بدون استفاده از وکتورهای رتروویروس‌ها به وجود آوردند (14).
1-1-5 سلولهای مغز استخوان عبارتاند از:
1-1-5-1 سلولهای بنیادی خونساز(HSC)16
سلولهای بنیادی خونساز مغز استخوان (چند توان) توسط توانایی منحصر به فردشان برای خودنوزایی و تمایز به تمام سلولهای خونی بالغ تبدیل میگردند (جدول 1-1) و همچنین واجد خصوصیات تشکیل کلونی میباشند (شکل 1-5) (15).
شکل 1-5: سلول بنیادی خون‌ساز، (www.medicalnewstoday.com)
1-1-5-2 سلول مزانشیم مغز استخوان17(BMMSCs):
سلول بنیادی مزانشیم از بافت‌های بالغی چون مغز استخوان، چربی، کبد، مایع آمنیوتیک، ریه، ماهیچه اسکلتی، کلیه و ژله وارتون بند ناف تخلیص می‌شود. سلول‌های مزانشیم مغز استخوان توانایی بالایی در تمایز به به سلولهای اکتودرمال، اندودرمال و مزودرمال چون رده‌های کندروسیت و استئوژنیک و چربی (آدیپوز) را دارند (جدول 1-1). همچنین این سلول‌ها در بهبود آسیب بافت‌هایی چون آسیب ریه، بیماری کلیوی، دیابت، سکته قلبی، آسیب کبد و ناهنجاری‌های عصبی نقش دارند (16).
سلول‌های بنیادی خون‌ساز مغز استخوان

پیش‌ساز رایج لمفوئید

سلولB
سلولT
سلول NK
پلاسما سل

پیش‌ساز رایج میلوئید
پیش‌ساز های اریتروئید- مگاکاریوسیت
ماست سل، بازوفیل، نوتروفیل، ائوزینوفیل، ماکروفاژ و استئوکلاستسلول‌های مزانشیم مغز استخوانسلول‌های کندروسیت، استئوبلاست، فیبروبلاست، آدیپوسیت، میوسیت، اندوتلیالجدول1-1: سلول‌های مشتق شده از سلول‌های خون‌ساز و مزانشیم مغز استخوان (16).
1-2 تاریخچه سلول بنیادی مزانشیم18
سلول بنیادی مزانشیمی نوعی سلول غیر خونساز ساکن در مغز استخوان و سایر بافتهای اسکلتی میباشد. حضور این سلولها در مغز استخوان برای اولین بار توسط یک پاتولوژیست آلمانی موسوم به کونهیم 19در حدود سال (1867) شناسایی شده بود. فردنستین 20در سال 1966 عنوان کرد که مغز استخوان شامل سلولهای پیچیدهای با مورفولوژی فیبروبلاستی شکل است که به صورت کلونی رشد کرده و توانایی تمایز به سلولهای استخوانی و غضروفی را داراست (17). او همچنین عنوان کرد که این سلولها در محیط کشت20 -30 مرحله تقسیم شده و همچنان پتانسیل تقسیم خود را حفظ می کنند. قدرت تکثیر این سلول ها با بالا رفتن تعداد پاساژ در محیط کشت کاهش مییابد. مشاهدات ابتدایی، توسط چندین محقق به ویژه پیرسما21و همکاران و اون 22و همکاران در طول سال 1980 توسعه پیدا کرد. این مطالعات نشان داد که سلولهای جدا شده با روش فردنستین سلولهای چند توان بوده و قادرند به ردههای استخوانی، غضروفی، چربی و حتی عضلانی متمایز شوند (شکل1-6) (17).
شکل1-6: عملکردهای اصلی سلول بنیادی مزانشیم (18).
1-2-1 مورفولوژی سلول بنیادی مزانشیم
سلولهای بنیادی مزانشیم از لحاظ مورفولوژیکی با یک جسم سلولی مشخص می شوند که پیرامون آن طویل و باریک است. جسم سلولی حاوی یک هسته بزرگ و گرد با یک هستک برجسته است. این هستک به وسیلهی ذرات کروماتینی که به مقدار کم پراکنده شده اند احاطه شده و این منجر به تفکیک واضح آن از هسته می گردد. بقیه جسم سلولی شامل مقدار کمی دستگاه گلژی، شبکه آندوپلاسمی صاف، میتوکندری و پلی ریبوزومها می باشد.
سلولهای استخراج شده از مغز استخوان کلونیهایی به صورت دوکی و تجمعات متقارن را تشکیل میدهند. برای شناسایی این سلولها میتوان از چسبندگی آنها به ظروف کشت استفاده کرد. بدین صورت که بعد از کشت سلولهای مغز استخوان در ظروف کشت، سلولهای مزانشیمی، لوکوسیتها و فیبروبلاست به کف ظرف چسبیده و بقیه شناور هستند، ولی با ادامه پاساژها سلولهای فیبروبلاست و لوکوسیتها توانائی چسبندگی خود را از دست داده و تنها سلولهای مزانشیم به کف فلاسک می چسبند (شکل 1-7) (19).
شکل 1-7: مورفولوژی فیبروبلاستی سلول‌های بنیادی مزانشیمال از مغز استخوان(www.gopixpic.com).
1-2-2 کنام23 سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان:
کنام یک سلول در حقیقت مجموعه‌ای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه می‌کنند. در حقیقت می‌توان از کنام به عنوان ابرحجم چند بعدی که سلول را احاطه کرده است، نام برد. کنام سلول بنیادی به عنوان یک ریز محیط24است که تعداد، تقسیمات، خودنوزایی و تمایز سلول‌های بنیادی را تنظیم می‌کند. این عمل به واسطه بیان بعضی ژن‌ها و همچنین سیگنال‌های خارجی مانند مواد شیمیایی موجود در دیگر سلول‎‌ها، تماس فیزیکی با سلول‌های مجاور و مولکول‌های معین ایجاد می‌شود (20). استخوان حاوی سلول‌های متفاوتی چون سلول‌های استرومال (استئوبلاست‌ها، آدیپوسیت‌ها، فیبروبلاست‌ها و سلول‌های اندوتلیال) و سلول‌های غیر استرومال است. استئوکلاست‌ها و استئوبلاست‌ها نقش اصلی در بازسازی استخوان و ساختار کنام ایفا می‌کنند. این سلول‌ها به واسطه بیان و ترشح تعدادی فاکتور، بلوغ و تکثیر دیگر سلول‌های مغز استخوان را تنظیم می‌کنند (شکل1-8) (21).
شکل 1-8: کنام سلول‌های بنیادی مغز استخوان (www.bioscience.org).
1-2-3 ویژگیهای اساسی سلول بنیادی مزانشیم
سلولهای مزانشیم مغز استخوان دارای سه ویژگی مهم زیر میباشند:
1) در شرایط کشت معمولی در ظروف کشت پلاستیکی به کف ظرف میچسبد.
2) شاخصهای سطحی CD105، CD73 و CD90 را بیان میکند و نسبت به بیان شاخصهای هماتوپویتیک به خصوص CD45، CD34 و سایر شاخصها از قبیل CD11b، CD19، HLA-DR منفی میباشند.
3) این سلولها توانایی تمایز به سلولهای چربی، غضروف و استخوان، در شرایط آزمایشگاهی را دارا میباشند (22).
1-3 کاربردهای سلول بنیادی مزانشیم در درمان25
سلولهای بنیادی مزانشیمی، دارای ویژگیهای بیمانندی هستند؛ که باعث می شود این سلولها به عنوان کاندید مناسبی برای فرایند سلول درمانی مطرح باشند (23). در واقع سلولهای بنیادی مزانشیمی، سلولهای پیشروی چندتوانی هستند که علاوه بر قدرت خوتجدیدی، میتوانند به انواع مختلف سلولها تمایز یابند و به همین دلیل آینده درخشانی در علوم ترمیمی برایشان پیش بینی میشود و از طرفی سلولهای بنیادی مزانشیمی که از طریق آسپیره کردن، پیوند میشوند، به عنوان یک منبع اتوژن قابل قبول از سلولهای بنیادی چندتوان مورد توجه هستند (24). مدارک تجربی نشان داده که این سلولها در درمان بیماریهای التهابی (25)، درمان بیماری ریوی (26)، آسیبهای قلبی (27)، دیابت ملیتوس (28)، بیماریهای عصبی چون پارکینسون (29) می توانند مفید واقع شوند. از مهم ترین کاربردهای سلول های بنیادی مزانشیم استفاده در زمینه درمان بیماری های استخوانی می باشد (شکل 1-9).
شکل1-9: کاربرد سلول بنیادی مزانشیم در درمان، (www.shigen.nig.ac.jp).
1-3-1 ترمیم استخوان:
اکثر آسیب‌های استخوانی در بدن به طور خود به خود درمان می‌شوند ولی در برخی موارد به علل گوناگون چون از بین رفتن بافت استخوان در اثر تومور و تعمیر نابجا و عفونت محل آسیب، این درمان خودبه خودی انجام نمی‌پذیرد. در این گونه موارد متخصصین ارتوپد از شیوه‌هایی چون پیوند استخوان و ایمپلنت‌های فلزی جهت ترمیم استخوان استفاده می‌نمایند. سلول بنیادی مزانشیم به دلیل توانایی خود در تمایز به دیگر رده‌های سلولی و به خصوص سلول استخوان نوید بخش استفاده از این سلول در درمان عارضه‌های استخوانی است (شکل1-10) (30).
شکل1-10: استفاده از سلول بنیادی مزانشیم در ترمیم جراحات استخوان، PRP (Platelet Rich plasma Preparation) (www.ejournalofdentistry.com).
1-4 بافت استخوان
از جمله بافتهای پیوندی بدن که کالبد و چهارچوب اصلی بدن را تشکیل میدهد بافت استخوان است. وظایف اصلی استخوان شامل: 1) مکانیکی 2) حفاظت (قفسه سینه و جمجمه) 3) متابولیک (ذخیره سازی و حفظ تعادل کلسیم و فسفر) می باشد. علاوه بر وظایف نام برده استخوان در تولید سلولهای خونی نیز نقش ایفا میکند. استخوانها از دو بخش، استخوان کورتیکال (80 تا 90% مواد معدنی) و استخوان ترابکولار (15 تا 25% مواد معدنی) تشکیل شدهاند. عملکرد استخوان کورتیکال بیشتر مکانیکی و حفاظتی است در حالی که استخوان ترابکولار بیشتر از نظر متابولیک فعال میباشد. استخوان اساسا از یک ماتریکس معدنی شدهی خارج سلولی تشکیل شده است و بخشهای سلولی کمی دارد. ماتریکس آلی استخوان بیشتر کلاژن تیپ I (90%) و مقادیر کمتری از سایر پروتئینها مثل استئوکلسین میباشد (شکل1-11). این ماتریکس آلی با رسوب کلسیم و فسفات، معدنی شده است. بافت استخوان از 3 نوع سلول به نام های استئوبلاست، استئوسیت و استئوکلاست تشکیل شده است. استئوبلاست‌ها و استئوسیت‌ها از سلولهای بنیادی مزانشیم بوجود می‌آید (شکل1-12) (,3231).
شکل1-11: ساختمان استخوان (en.wikipedia.org).
شکل 1-12: منشا سلول‌های تشکیل دهنده استخوان (استئوبلاست، استئوکلاست، استئوسیت) (archive.unu.edu)
الف) استئوبلاست‌ها:
سلولهای سازنده بافت استخوان هستند که به ترشح ماتریکس آلی می‌پردازند. این سلولها، ظاهری پهن با قطر 30-20 میکرومتر دارند و یک هسته گرد غیرمرکزی با سیتوپلاسم بازوفیلی (به دلیل حضور تعداد زیادی شبکه آندوپلاسمی خشن) و دستگاه گلژی برجسته و مشخص دارند. غشای پلاسمایی استئوبلاست‌ها غنی از آنزیم آلکالین فسفاتاز است که به عنوان یک مارکر مشخص در تشخیص استئوبلاست‌های بالغ در محیط کشت به کار می‌رود. استئوبلاستها، استئوئید را که ماتریکس استخوانی غیرمعدنی و ترکیبی از کلاژن و سایر اجزای آلی است را سنتز می‌کنند (32).
ب)استئوکلاست‌ها:
سلول‌های بزرگ (100 میکرومتر)، غنی از میتوکندری و لیزوزوم، چند هسته‌ای (بیش از 10 هسته) که از سلول‌های پیش‌ساز گرانولوسیت/ماکروفاژ به وجود می‌آیند. این سلول‌ها حاوی آنزیم اسید تارتارات فسفاتاز (TRAP)26 بوده که عمل فسفریلاسیون پروتئین‌ها را انجام می‌دهد. علاوه بر این دارای تعداد زیادی رسپتور برای کلسیتونین می‌باشند. نقش اصلی این سلول‌ها در تجزیه استخوان و آزادسازی مواد معدنی استخوان چون کلسیم به خون است (32).
پ) استئوسیت:
سلولی با ظاهری ستاره‌ای شکل و منشعب، اندازه متغیر بین20- 5 میکرومتر، با نیمه عمری 25ساله و بدون تقسیم می‌باشد. بخشی از استئوبلاستهای فعال در ماتریکس تازه ترشح شده‌گیر افتاده و به استئوسیت‌ها در فضایی به نام لاکونا تبدیل میشوند (32,33) .
ت)ماتریکس استخوان
ماتریکس استخوان متشکل از مواد آلی و املاح معدنی است :
1) ترکیب معدنی (69%)، شامل 99% هیدروکسی ‌آپاتیت
2) ترکیب آلی (22%)، شامل پروتئین‌های کلاژن (90%) و غیر کلاژنی چون پروتئوگلیکان، سیالوپروتئین، 2HS-گلیکوپروتئین27 (32).
1-5 استئوژنز(استخوان‌سازی)
استئوژنز یک پروسه تکاملی می‌باشد که تعداد زیادی از عوامل بیرونی مثل هورمونها، فاکتورهای رشد، مسیرهای پیام رسان و فاکتورهای رونویسی در آن دخالت دارند. در پروسه تمایز استئوبلاستی تقسیم اولیه سلولهای بنیادی مزانشیمی نامتقارن بوده و باعث تولید دو نوع سلول می‌شود که یکی سلول stem cell می‌باشد و دیگری یک سلول پروژنیتور متعهد به رده استئوبلاستی می‌باشد دو گام مهم در تمایز استئوبلاست‌ها از سلولهای MSCs وجود دارد؛ که عبارتند از :
1- مرحله گذر از سلول بنیادی مزانشیمی به سلولهای پروژنیتور متعهد به رده استئوبلاستی یا مرحله گذر 28
2- تمایز انتهایی و متوقف شدن چرخه سلولی (32).
استخوان‌سازی به دو صورت: 1) اولیه یا جنینی 2) بعد از تولد یا ثانویه تقسیم‌بندی می‌شود.
1-5-1 استخوان‌سازی اولیه یا جنینی
این نوع بافت اولین بافت استخوانی است که در دوران جنینی و تعمیر شکستگی شکل می‌گیرد. مشخصه این نوع بافت قرارگرفتن فیبرهای کلاژن به صورت تصادفی است.
در جریان جنین‌زایی، تکامل استخوان دراز تحت تاثیر فرآیندی به نام استخوان‌زایی درون غضروفی 29و استخوان پهن به کمک فرآیندی به نام استخوان‌زایی درون غشایی30 صورت می‌گیرد.
الف) استخوان‌سازی درون غضروفی
استخوان‌های طویل (فمور، تیبیا، استخوان بازو، رادیوس) در اوایل رشد جنین به فرم غضروف می‌باشد و از فشردگی بافت مزانشیم، کندروسیت به وجود می‌آید. استخوان‌سازی غضروفی در نقاطی از غضروف به نام مرکز ابتدایی استخوان‌سازی شروع می‌شود و حاصل آن در اوایل تولد جنین استخوانهای کوتاه می‌باشد. همچنین شکل‌گیری دیافیز استخوان‌های دراز، استخوان‌های کوتاه، ….بر عهده این نوع استخوان‌سازی است (شکل 1-13).
ب) استخوان‌سازی درون غشایی
این نوع استخوان‌سازی مسئول شکلگیری استخوان‌های پهن چون جمجمه، فک، آرواره و ترقوه می‌باشد. مراحل این فرایند شامل: 1) شکلگیری مرکز استخوان‌سازی 2) کلسیفه‌شدن 3) تشکیل ترابکولار 4) رشد پریستئوم (پوشش استخوان).
فرم این نوع استخوان‌ها در حالت جنینی به صورت بافت همبند مزانشیم است و گروهی از این سلول‌ها متمایز شده و به سلول‌های استئوبلاست مبدل می‌شوند. استئوبلاست‌ها در ابتدا ماتریکس غیرمعدنی و رشته‎‌ای شکل استئوئید را ترشح کرده که در نهایت معدنی شده و به استخوان فشرده تبدیل می‌گردد (32) (شکل1-14).
شکل 1-13: فرآیند استخوانی شدن درون غضروفی با فشردگی مزانشیم:a) تجمع سلول‌های پیش استئوبلاست b)تشکیل غضروف هیالن c) مرکز ابتدایی استخوان‌سازیd) مرکز ثانویه استخوان‌سازیe) استخوان با حفره مغزی و انتهاهای اپی‌فیزال f) رگ‌های خونی تغذیه‌کننده – منبع:(32).

شکل1-14: استخوان‌سازی درون‌غشایی: a) تجمع سلولهای پیش‌ساز استئوبلاست، b) ماده زمیته بی‌شکل و شبکه کلاژن شکل گرفته در مرکز و بین سلول‌ها، c) سلول بنیادی مزانشیم تمایزیافته به استئوبلاست‌ها که استئوئید را سنتز می‌کند، d) بافت استخوان ابتدایی توسط استئوبلاست‌ها شکل‌گرفته است (32).
1-5-2 استخوان‌سازی ثانویه
پس از تولد بافت جنینی با استخوان بالغ (ثانویه) جایگزین می‌گردد. در این مرحله رشد طولی و عرضی استخوان انجام می‌شود و تا حدود سن 21 سالگی ادامه دارد. این نوع از استخوان‌سازی تحت تاثیر عواملی چون ژنتیک، تغذیه و عوامل محیطی می‌باشد (32).
1-5-3 دوباره‌سازی31 استخوان
دوباره‌سازی استخوان فرآیندی حیاتی ‌و پویا در بافت استخوان بالغ بوده که شامل مرحله‌ی حذف اسکلت استخوان (بازجذب استخوان32) و مرحله‌ی شکل‌گیری استخوان جدید (استخوان‌زایی33)است. فرآیند دوباره‌سازی برای تکامل، بلوغ، حفظ و نگهداری استخوان ضرورت دارد. در هر دو مرحله این فرآیند مسیرهای سیگنالی میزان مناسبی از رشد و تمایز را موجب می‌شوند. این مسیرهای سیگنالی شامل فعالیت هورمون‌هایی چون پاراتیروئید (PTH)، 1و 25 دی هیدروکسی کوله کلسیفرول، هورمون رشد، استروئید و کلسی‌تونین و سایتوکین TGF-β، IGF می‌شوند (35, 36). هر دو فرآیند تجزیه و ساخت نه تنها از بعد کمی بلکه از بعد زمانی و مکانی نیز هماهنگ هستند و در صورت وقوع عدم تعادل بین این دو فرآیند بیماری حاصل می‌گردد. به طور مثال زمانی که استئوکلاست‌ها افزایش فعالیت و یا استئوبلاست‌ها کاهش فعالیت داشته باشند، پدیدهی پوکی استخوان حادث می‌شود (شکل1-15).
شکل1-15: دوباره‌سازی استخوان، جذب استخوان توسط سلول استئوکلاست و تشکیل استخوان توسط استئوبلاست انجام می‌گیرد(32) .
1-6 هتروژن بودن کشت سلول بنیادی مزانشیمی
از ویژگی‌های شاخص سلول‌های مزانشیمی کلون‌زا بودن این سلول‌ها در کشت اولیه است. کلونی‌های منفرد که هرکدام از یک سلول مشتق شده است، از لحاظ پتانسیل تمایز هتروژن هستند. حدود یک سوم کلون‌های کشت اولیه سلول‌های چسبنده مغز استخوان از لحاظ تمایزی چندتوان بوده و قادرند به سه رده استخوان، غضروفی و چربی تمایز یابند. در حالی‌که بقیه تنها پتانسیل دو رده‌ای (استخوان و غضروف) یا تک رده‌ای (استخوان) دارند.
سلول مزانشیم مغز استخوان پتانسیل تمایزی به هر سه رده را دارد (32). سلولهاي بنيادي مزانشيمي مغز استخوان، تحت شرايط خاصي توان تمايز به انواع سلولهاي غير مزانشيمي نظير سلولهاي كبدي، سلولهاي ششي (37)، سلولهاي عضله اسكلتي، سلولهاي عضله صاف (38)، سلولهاي عضله قلبي، سلولهاي اپيتليال روده اي و نورون (39)را نيز دارند.
1-6-1 شرایط آزمایشگاهی تمایز مزانشیم به استخوان
برای تمایز به استخوان، روش کار آزمایشگاههای مختلف یکسان است. برای این منظور پس از این که سلول‌های بنیادی مزانشیم جدا شدند و با انجام چند پاساژ تکثیر یافتند، سلول‌های پاساژ 2یا 3 با استفاده از محیط کشت مناسب (DMEM) حاوی 15-10 درصد سرم گاوی کشت داده شده تا به مرحله confluency (مرحله ای که در آن تمام کف ظرف پر از سلول است) برسند.



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه ها

دیدگاهتان را بنویسید